高蛋白饲料桑：不同杀青方式制备桑叶茶及其体外抗氧化作用研究-儿童城

高蛋白饲料桑：不同杀青方式制备桑叶茶及其体外抗氧化作用研究

时间：2018-02-25 02:03:55 来源：蛋白桑兴农作者：杀青点击：

导读：高蛋白饲料桑：不同杀青方式制备桑叶茶及其体外抗氧化作用研究2018-02-25 01:14 来源：蛋白桑兴农摘要不同杀青方式制备桑叶茶及其体

摘要不同杀青方式制备桑叶茶及其体外抗氧化作用研究摘要本实验以桑叶为研究对象，采用绿茶加工工艺制备桑茶，特别考虑采用影响绿茶品质最重要的不同的杀青工艺并进行优化处理，制备目标功能成分含量高及滋味品质好的桑茶。同时考虑桑茶含有的抗氧化成分差异，研究了不同溶剂提取对桑茶抗氧化活性的影响，分别采用了体外抗氧化方法和细胞内抗氧化方法对桑叶茶不同溶剂的抗氧化能力进行了研究，并对两种方法的测定结果做了相关性分析，为研究桑茶工艺特点，生物活性成分与其抗氧化活性之间的相关性提供了相关研究数据。研究结果如下：1桑叶茶杀青工艺的研究1．1桑叶茶杀青工艺的优化通过对微波杀青、漂烫杀青和蒸气杀青三种杀青方式中杀青温度( 功率) 、杀青时间、投叶量进行单因素实验和正交实验，以POD活性以及感官评定为杀青效果评判指标，确定了三种杀青方式的最佳工艺参数，结果如下：微波杀青最佳工艺条件为：微波功率300W，微波时间2．5mi n，投叶量909。漂烫杀青最佳工艺条件为：漂烫温度95℃，漂烫时间4rai n，投叶量1209。蒸汽杀青最佳工艺条件为：杀青时间3．5mi n，投叶量909。由最佳工艺条件制备的杀青叶感官评分高，杀青叶叶质柔软，青草气较轻，香气明显，叶质柔韧。1．2不同杀青工艺对桑叶茶化学成分的影响将桑叶按上述最佳工艺条件进行杀青，然后进行揉捻、干燥，制成成品茶。以桑茶的滋味和色泽品质成分、主要功能成分为主要评价指标，并结合感官评定，三种杀青工艺处理综合效果以微波杀青方式制备的桑叶茶最好，微波杀青处理的桑茶的水浸出物含量占干物质的12．36％，可溶性糖和游离氨基酸的含量分别为干重的3．48％、2．78％，主要功能成分一多酚和黄酮类化合物的保留量分别为11．56mg／g．干重、7．52mg／g．干重。2不同杀青方式制备的桑叶茶体外抗氧化作用比较西南大学硕士学位论文2．1不同杀青方式制备的桑叶茶体外抗氧化活性的比较分析在氧自由基吸收能力方面，三种杀青方式制各桑茶的醇浸出物的ORAC值均较高，其中微波杀青桑叶茶50％乙醇浸出物的的氧自由基清除能力最强，ORAC值为1437．4士96．251amol ／g；漂烫杀青桑茶沸水浸出物的ORAC值最低，为764．9士102．88gmol ／g。DPPH自由基清除能力的比较中，三种杀青方式制备桑茶的沸水浸出物均表现出较强的自由基清除能力，清除效果均高于50％和95％的乙醇浸出物。微波杀青桑叶茶在75％7, 醇溶液的浸出物的IC50值最小，为139．34士11．70pg／mL，表明其DPPH清除能力最强。还原力大小的比较中，微波杀青桑叶茶在75％乙醇溶液中的浸出物还原力最强，三种杀青方式桑叶茶的50％乙醇溶液浸出物均表现出较强的还原能力。2．2桑叶茶提取物总酚和总黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析不同溶剂对桑叶茶浸出物中总酚的含量有不同影响，三种桑叶茶的沸水浸出物中总酚类的含量均较高，桑叶茶醇浸出物中总黄酮类随乙醇浓度的升高先增加后减小，当乙醇浓度为75％时，总黄酮含量均达到最大值，与其他溶剂提取物相比都有显著性差异( p<0．05) 。尽管桑叶茶沸水浸出物的抗氧化能力最强，但是其总酚和总黄酮含量都不是最高的，根据相关性分析结果，用总酚和总黄酮含量不能准确评价桑叶茶不同提取物的抗氧化性。3桑叶茶不同溶剂提取物细胞抗氧化作用研究3．1桑叶茶不同提取物的细胞内抗氧化( CAA．RBC) 能力分析CAA．RBC法的结果表明桑叶茶不同溶剂提取物细胞抗氧化活性的大小为：50％乙醇提取物>75％乙醇提取物>95％乙醇提取物>沸水浸出物，桑叶茶水提取物的细胞内抗氧化活性最小，其EC50为380．81399／mL，约是50％乙醇提取物的1／4，与不同浓度乙醇提取物的EC50值相比均存在着显著性差异( p<0．05) 。桑叶茶50％乙醇提取物抗氧化活性略高于75％乙醇提取物。3．2桑叶茶提取物功能成分含量与细胞内抗氧化活性的相关性分析细胞内抗氧活性与总酚、总黄酮含量正相关性较弱，相关系数分别为o．216、0．129，这与体外抗氧化方法得到的结果相似。桑叶茶不同提取物的细胞抗氧化能力与化学抗氧化能力没有直接相关性，有些化学抗氧化能力很强的成分其细胞抗Il 摘要氧化能力都非常小，无法计算EC50。所以化学抗氧化能力很强的物质不一定就能够进入体内清除自由基，也就是说单独用化学抗氧化方法评价某物质的抗氧化能力并不科学，建议通过建立细胞模型测综合评价抗氧化性。关键词：桑叶茶；杀青工艺；多酚类；黄酮类；体外抗氧化；细胞内抗氧化；

1．1桑叶概述桑是桑科( Moraceae) 桑属多年生落叶小乔木植物，偶有灌木。桑原产于中国和朝鲜，全球约有16种，分布于北温带、亚洲热带和非洲热带及美洲地区，我国约有11种，以江浙一带为多�6�8 。中国是栽桑养蚕最早的国家。桑皮可作造纸原料，桑椹可供食用、酿酒，叶、果和根皮可入药。叶为桑蚕饲料。桑叶不仅可用作家蚕的饲料，而且被作为一种发散风热药在我国医药中广泛应用。中医古籍强调“ 霜桑叶” 或“ 冬桑叶” 入药。桑叶始载于《神农本草经》，历代本草均有收载。桑叶苦、甘、寒，归肺、肝经，具有疏散风热、清肺润燥、平肝明目、凉血止血之功效。现代药理学研究显示，桑叶具有降糖降脂、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性，自二十世纪七十年代以来，人们对桑叶中的次生代谢产物进行了大量研究报道，从中提取分离并鉴定出多种化合物。

1．1．1桑叶的生物活性成分

1．1．1．1黄酮类化合物黄酮类物质是一种天然的强抗氧化剂，能够清除人体中的多种自由基等，具有降血压、抗衰老、防癌，抑制血清脂质增加和抑制动脉粥样硬化形成的作用。桑叶中的黄酮类化合物占干重的1％～3％，这些化合物主要包括芸香苷、槲皮素、异槲皮素、芦丁、黄芪苷、异戊烯基黄烷等。日本学者Kayo掣51对桑叶的丁醇浸出物进行分离，得到9种化合物，尤其富含芸香苷，平均每1009干品中，含芸香苷470～2670mg。

1．1．1．2多糖桑叶多糖具有显著的降血糖作用，但关于其抗氧化方面的研究少有报道。研究表明，桑叶多糖在清除桑叶多糖可以显著清除化学模拟体系产生的OH· 自由基，是一种优良的OH· 清除剂，对DPPH· 也表现出一定的清除作用。此外，桑叶多糖能显著降低H202诱导的小鼠肝脏MDA的形成和积累，并存在显著的剂量效应。以上结果表明桑叶多糖具有良好的抗氧化作用。

1．1．1．3生物碱1一脱氧野尻霉素是一种哌啶生物碱，简称为DNJ 。日本学者Asano掣61通过改变DNJ 的提取和纯化工艺，从桑叶中分离出多种多羟基生物碱，包括DNJ 、N一甲基一1一DNJ (NMe—DNJ )、2一氧一13, ．D半乳吡喃糖苷．1．DNJ 、1, 4．二脱氧．1，4一亚胺基一D．阿拉伯糖醇、l ，4．二脱氧．1，4．亚胺基一(2．氧．B．D一吡喃葡萄糖苷)一D一阿拉伯糖醇两南大学硕士学位论文等。DNJ 是一种天然糖的类似物，能够抑制糖苷酶，能明显抑制进食后血糖急剧上升现象。

1．1．1．4植物甾醇桑叶中植物甾醇含量比一般植物高3～4倍，由于植物甾醇同胆固醇在乳糜微粒的竞争，使得原本就溶解度不大的胆固醇成为不被吸收的状态，从乳糜微粒中析出，而不能从肠道中进入血液，从而能有效的抑制肠道对胆固醇的吸收。植物固醇还可以促进胆固醇的排泄，Hayes等t71的研究提示，游离植物固醇能促进沙鼠内源性胆固醇的排泄。

1．1．1．51，一氨基丁酸桑叶中含有丰富的丫一氨基丁酸，丫一氨基丁酸由谷氨酸转化而来，而桑叶中谷氨酸含量很高。GABA是中根神经系统的抑制性传递物质，是脑组织中最重要的神经递质之一。其作用是降低神经元活性，防止神经细胞过热( over fi ri ng) ，所以可从根本上镇静神经，起到抗焦虑的效果；同时，能提高葡萄糖磷酸酯酶活性，促进脑组织的新陈代谢和恢复脑细胞功能‘ 81。1．I．2桑叶保健功效Ⅲ51桑叶正是由于具有上述多种生物活性成分，因而有不少关于桑叶具有降血糖、抗应激、抗衰老、降血压、增强肌体耐力，调节肾上腺素、降低胆固醇、抑制血栓生成，抑制肠内有害细菌繁殖，抗氧化、抗癌、抗过敏、防止动脉硬化、抗毛细管渗透、利尿、抑制对重金属的吸收、抑菌、杀虫、抗丝虫病等多种功能，还具有治疗秃头症和减肥的药用效力。最突出的功能是防止糖尿病，所以是一种价廉物美的新型功能性食品的基料。

1 . 2茶的加工概述

1．2．1茶的一般加工工艺我国是世界上茶类最丰富的国家，根据加工工艺方法和品质特征可划分为绿茶、黄茶、黑茶、白茶、乌龙茶和红茶六大类。它们的品质风味各具一格，一方面是由于六大茶类对鲜叶原料的品种和嫩度要求不尽相同，更重要的是加工方法各异影响的品质特征的实质主要是化学成分含量及组成的差异性。

1．2．1．1绿茶(green tea)工艺及品质形成[16-181绿茶是我国最主要的茶类，也是我国生产最多的茶类，约占总产量80％以上。中国所有产茶省( 区) 中，都有绿茶生产。由于我国的茶树品种优良，自然条件第1章文献综述适宜，加工工艺精良，从而形成了外形优美、高香、味道浓醇、汤色黄绿明亮、叶底嫩绿的绿茶风格。绿茶加工工艺如下：鲜叶_摊放一杀青一揉捻-÷ 分筛_÷ 烘二青。绿茶加工品质形成关键工序是杀青。杀青就是采用高温钝化鲜叶中生物酶的活性，尽量减少酚类物质的氧化和叶绿素的破坏，以形成绿茶倾听绿叶的品质特点。但是因为杀青方式不同，如采用蒸汽杀青、锅炒杀青、水潦杀青和微波杀青等不同方法，则可在很大程度上影响绿茶制品品质。

1．2．1．2红茶(bl ack teal 工艺及品质形成吟211红茶是占世界上茶叶消费量75％以上的茶类，也是我国生产的主要茶类之一，约占总产量的7％。消费红茶的主要形式为红碎茶。也有工夫红茶。鲜叶_萎凋一揉切_解块一发酵一烘干_精制筛分_红碎茶红茶加工关键工艺是发酵，就是在前期萎凋使鲜叶失水，引起以大分子降解为主导的分解反应的基础上，使鲜叶中的成分在酶的作用下发生氧化作用、酚类物质氧化、叶绿素降解，而形成红茶特有的红汤红叶的品质特点。

1．2．1．3乌龙茶(ool ongtea)-l--黼质形成乌龙茶属于半发酵茶，是我国特有的茶叶加工类型，约占总产量的11％。有福建闽南、闽北的铁观音和武夷岩茶等、广东的凤凰单丛和台湾的乌龙茶等。每个不同的产地因为茶树品种的差异以及加工工艺要点的把握而形成了不同产地乌龙茶特有的品质特点。乌龙茶一般加工工艺如下：鲜叶_萎凋_做青_杀青-÷ 揉捻一干燥乌龙茶加工关键工艺处理是做青，即通过叶子放在太阳下萎凋，然后在竹筛中抖动，轻轻擦伤叶子边缘，由于擦伤叶子中的茶多酚发生氧化反应，使得叶子边缘转变为微红色，然后采用杀青工艺处理使这个轻微发酵立即停止，最终形成乌龙茶汤色为黄色或偏红，具有花香或果香，外形绿叶红镶边的品质特征。

1．2．1．4其他茶类工艺及品质形成白茶是在茶叶新芽在张开以前就被采摘下来，先让其水份自然蒸发，使叶片枯萎，然后干燥，也称为日晒茶，也是我国独有的茶叶加工品类，因叶满布白毫而得名，以鲜爽为上，香气清新。主要加工工序为鲜叶～萎凋～干燥。萎凋是白茶品质形成重要工序。黄茶是我国特有茶类，干茶显黄亮，茶汤呈嫩黄色，黄叶黄汤，香气多板栗香。主要加工工序：鲜叶一杀青_闷黄一干燥。因此黄茶主要加工工序为闷黄，通过闷黄将杀青叶趁热堆积，使茶坯在湿热条件下发生热化学变化，最终使叶子全部均匀变黄为止。黑茶多为边销茶，汤色橙黄、香气纯J 下、滋味醇厚不涩，叶底黄褐均匀。加工工序：鲜叶一杀青一揉捻一÷ 渥堆．÷ 干燥。渥堆是黑茶初制独有的工序，也是黑茶色香味品质形成的关键工序。主要是在湿热、微生物作用下多酚类物质自动氧化的结果。

1．2．2我国茶饮及加工技术的发展方向茶叶是我国重要的经济作物，近年来，国际市场茶叶需求量不断增大，这对我国茶叶在国外市场的开拓，提供了机遇。

1．2．2．1围绕品质进行茶叶加工技术开发我国茶叶生产和加工存在的问题是，绿茶产品种类单一、加工较粗糙、色泽欠绿和烟焦味重等品质问题。为此，进行绿茶加工品质改进，加大新型绿茶加工技术的开发力度，是我国绿茶生产乃至我国整个茶产业发展的当务之急。近年来，有关加工工艺和设备的研究开发已取得相当进展。为了使绿茶产品色泽绿翠、保持良好香气并消除烟焦味，将日本现行使用的蒸汽杀青和我国传统使用的炒青干燥工艺相结合，提出一种新型蒸炒型绿茶加工工艺技术‘ 2酣。有关茶叶设备生产企业，还开发出相应的蒸汽杀青设备，己在部分茶区开始应用，使加工的绿茶产品香气滋味获得较明显改善，并且根除了传统绿茶加工所易形成的烟焦味，只是要在蒸青后的脱水环节和产品绿翠保持技术上作进一步的改进和突破，很有可能形成一种新型绿茶产业化加工技术。

1．2．2t2名优茶将追求标准和规范化加工在一定时期内，名优茶仍将是我国茶产业的主导产品。名茶种类繁多，加工工艺和炒制手法各异，全国名茶种类达千种之多，但仅停留于手工艺品或样品水平。同产品质量参差不齐，难以形成规模化加工和生产，严重制约着名优茶的市场和产业化优势的形成。今后发展的趋势是，茶区各地将应尽快按名茶加工工艺进行产品归类，统一名茶产品的名称和加工工艺技术，采用各种必要调控手段，减少名优茶的品类，避免同一类名茶名称多样，做到名茶生产一地一品。分门别类制定各种名茶的产品加工标准，统一同一类名茶的加工工艺、质量和规格，减少名优茶的等级数目。从而增强名优茶的市场竞争力。

1．2．2．3茶叶产品将继续向着多样化、方便化的方向发展当今世界的茶叶生产和消费，正向着方便、多样性、健康、经济、质量、综4 第1章文献综述合性的方向发展。茶叶作为一种广受欢迎的天然饮料，随着综合利用的日益广泛，茶叶在饮料、食品、医药等领域的应用研究正积极展开。同时，随着人们生活水平的提高和饮茶习惯的改变，质量好、附加值高和应用高新技术开发生产的新型绿茶、速溶茶、袋泡茶、茶水饮料等产品，将成为茶叶消费新的增长点。例如以传统茶叶作原料，经高科技提取、过滤、调配而形成的天然液体茶饮料，既具有茶叶的独特风味，又可开盖即饮，清洁卫生，适应当代人们生活节奏加快和现代化的潮流，近几年发展速度很快。

1．2．2．4茶叶深加工产品的开发和生产力度将加大茶叶中含有数量众多的有益于人体健康、可作为食品及医药添加的有效成分，并且大多可从较粗老的大宗茶原料中提取，产品附加值高，可使市场上因结构性原因而较滞销的大宗茶原料获得利用。目前我国的茶叶有效成分的制备，主要集中在茶多酚的提取和应用上【291，其次是咖啡因、茶多糖、茶色素，制备技术已经具备，但应用领域和技术尚待进一步开发：与此同时，我国已掌握单体儿茶素的制备技术，但工业化生产和应用技术还需深入研究和开发；茶氨酸的制备技术在研究中。

1．2．2．5新型茶饮的崛起随着经济的发展和人们生活水平的提高，人们对饮食与健康的要求也日益增高，除了对传统茶饮的发展以外，人们也更加关注非茶类健康饮品的开发，如银花茶、菊花茶、荞麦茶、金莲花茶、桂花茶、荷叶茶等等花草茶的开发及一些新资源花草茶的开发，茶已经变成这些健康饮品的代名词。因此，新型茶饮的开发备受关注。

1．3生物活性物质体外抗氧化研究及抗氧化功能成分研究概述

1．3．1生物活性物质体外抗氧化评价方法概述氧化应激与许多病理学因素有关，如心血管病变、神经变性、癌症和衰老等。大量的临床与流行病学研究显示，消费富含生物活性物质的水果、蔬菜既可以有效降低癌症、心血管疾病和其他一些慢性疾病的发病率，又可以适度改善身体健康状况。为此，天然产品的抗氧化能力成为了该领域的研究热点，近年来建立了许多体外抗氧化能力的化学评价方法。抗氧化能力的的化学评价方法主要测定抗氧化剂针对某一种或某一类自由基的清除或抑制作用，作用机制主要有以下几点：1) 抑制脂质过氧化；2) 清除自由基；3) 影响抗氧化酶的生物活性；4) 减少DNA的氧化损伤。西南大学硕士学位论文

1 . 3．1．1．DPPH· 法DPPH法是Bl oi s于20世纪50年代提出的，最初用于发现食物中的供氢体，后来被广泛用于定量评价生物制品、酚类和食品的抗氧化能力阻351。DPPH-法进行定量分析，测定简便、快速，同时DPPH· 较长的半衰期使该方法保持了良好的重现性。DPPH-在有机溶剂中较为稳定，在波长517nm处有强吸收，当DPPH自由基清除剂存在时，DPPH· 的单电子与抗氧化剂中的H质子配对而被还原，溶液变浅，在517ri m处的吸光值降低，且这种颜色变浅的程度与配对电子数成化学剂量关系，即吸光值越低，样品清除DPPH自由基能力越强，从而用于评价实验样品的抗氧化能力四。

1．3．1．2清除羟自由基(· OH)测定方法以清除羟自由基为基础的化学评价方法较多，如亚硝基R盐一C03+褪色法、水杨酸法、邻二氮菲一Fe2+氧化法。基本原理都是通过氧化还原反应影响有色物质的含量变化，吸光值也会随之发生改变，从而可判断和评价供试样品的抗氧化性能。赵艳红等[341用邻二氮菲．Fe2+氧化法、水杨酸比色法和亚硝基R盐一C03+褪色法检测茶多酚清除· OHfi 甚力，发现在实验浓度范围0～o．6mg／mL内均呈比较明显的量效关系，进一一步的相关性分析表明，亚硝基R盐．C03+褪色法的线性相关系数最接近1，可靠性最好。精密度和重现性分析中，亚硝基R盐．C03+褪色法对茶多酚测量结果的RSD值明显低于其他两种方法，表明该方法的精密度和重现性都好。

1．3．1．3铁离子还原能力( FRAP) 法铁离子还原能力法由Benzi ei 建立，pH较低时，抗氧化功能物质能将三吡啶三嗪价三价铁( TPTz．Fe3+) 的物质还原为蓝色的三吡啶三嗪二价铁( TPTZ—Fe2+) 。反应的结果常以Fe2+当量或标准物质的抗氧化能力表示。其优点是简便、快捷、结果重复性较好。

1．3．1．4总氧自由基清除厶邕力(TOSC)法通过某种特定抗氧化成分或自由基代谢产物的变化研究生物抗氧化能力难以准确反映生物实际抗氧化应激的能力，因为单一成分的变化尚不能完全说明氧化损伤已经发生及其程度。Wi nston等建立的总氧自由基清除能力( TOSC) 法克服这种局限性，以气相色谱或液相色谱为检测手段检测机体的总氧自由基清除能力，其优势是能较全而地反映机体的抗活性氧毒性能力的实际水平，是目前测定总氧自由基的常用方法[37-391。

1．3．1．5氧自由基吸收能( ORAC) 法6 第1章文献综述oRAc法是建立在Gl azer实验基础上的一种检测抗氧化能力的方法。p一藻红蛋白( 13-phycoerythri n，p．PE) 为荧光指示蛋白，在AAPH· 、Cu2+．H202体系产生的自由基攻击下在565nm波长下的荧光度会减弱或消失，通过与VE类似物Trol ox的抗氧化能力进行直接比较而得到抗氧化能力的当量值，根据其荧光强度衰减曲线变化计算出样品的自由基清除能力‘ 40‘ 411。Laura Bravo[ 421在ORAC的基础上，对Il exparaguari ensi s的抗氧化机制做了深入的研究，结果表明多酚类物质含量与抗氧化能力呈正相关，主要功能成分包括儿茶素、黄酮类、花色素和酚酸，其中儿茶素最为重要，约占多酚类总量的60％～80％。

1．3．2抗氧化功能成分研究概述植物浸出物的抗氧化活性成分主要有黄酮类化合物、多酚类化合物、维生素等类型。

1．3．2．1黄酮类化合物黄酮类化合物是大都具有显著的抗氧化功能，槲皮素、葛根素、金丝桃苷、桑色素、山奈酚等。从金莲花、竹叶、黄芪、葛根和沙棘等醇提物分离的黄酮类物质均具表现出较强的自由基清除能力。唐津忠等【471研究了金莲花中黄酮类化合物的提取及其对猪油的抗氧化作用，结果表明，黄酮类化合物对猪油有明显的抗氧化作用，黄酮类化合物的添加量在试验剂量范围内与其抗氧化性呈正相关；金莲花中黄酮类化合物与Vc有较好的增效协同效应。陆柏益[ 48] 研究了竹叶黄酮的体内外抗氧化活性，实验表明，竹叶黄酮具有清除自由基、抗脂质过氧化、提升体内抗氧化水平的作用。

1．3．2 12多酚类化合物植物多酚又称植物单宁，是植物体内的复杂酚类次生代谢产物植物多酚由于其所具有的独特功能活性，已成为当今研究开发的热点，并在现实生产中得到广泛应用。宋薇薇等‘ 521研究了石榴皮提取物对羟自由清除作用和小鼠肝匀浆脂质过氧化的抑制作用，结果表明，石榴皮中的多酚物质能抗氧化作用明显，其半抑制浓度IC50，EC50分别0．288mg／mL、O．0079mg／mL。茶多酚能有效灭活体内的自由基，对自由基引起的氧化损伤有很好的防护作用。研究表明，茶多酚能对紫外线引起的人红细胞溶血及维生素C／Fe2+激发的肝匀浆谷胱甘肽耗竭均有显著的抑制作用。能保护体外红细胞、组织谷胱甘肽及DNA免受氧自由基损伤。

1．3．2．3维生素类【54删】维生素E、维生素c及其衍生物，既是食品营养素，又可作为抗氧化剂。许多西南大学硕士学位论文水果和蔬菜中富维生素E、维生素C等物质。水溶性维生素C可以协同维生素E抵抗氧自由基，其机理为维生素C消除环境中的氧自由基而保护维生素E，节省维生素E的使用。维生素E是脂溶性小分子抗氧化剂代表性物顷．可以防止细胞膜上的脂质被氧化，否则因其氧化产生的脂褐素会促使细胞衰老，从而影响组织器官的生理功能。蔬菜中的p一胡萝卜素或番茄红素可与过氧化氢自由基反应生成碳自由基而稳定下来。水溶性维生素B族是若干抗氧化酶的辅酶，使抗氧化酶起到清除自由基等抗氧化的作用。

1．3．2．4皂苷类近年来的研究表明，皂苷大多具有明显的抗氧化作用，皂苷类的抗氧化作用则可能是其延缓衰老、抗动脉粥样硬化、抗缺血再灌注损伤等药理作用的共同作用机制。根据苷元的化学结构分为甾体皂苷和三萜皂苷两类。人参、刺五加、升麻、黄芪中含有萜类皂苷，麦冬、洋地黄、党参中含有甾类皂苷，这些皂甙均可抑制自由基的形成[ 601。其他具抗氧化活性的皂苷还有三七总皂苷、西洋参皂苷、绞股蓝皂苷。柴胡根含皂苷约2％，主要皂苷为柴胡皂苷a、c年l J d，果实亦含多种皂苷。党参根含三萜类化合物、皂苷、多种甾醇和甾苷等。人参皂苷Rb 1和人参皂苷R93的混合物能阻止神经元产生过量硝酸，延缓衰老。

1．3．2．5其他类现代研究发现，多糖可通过直接清除ROS、络合产生ROS所必需的金属离子等途径实现抗氧化作用。香菇、灵芝、猪苓和木耳等真菌子实体提取的多糖也具有防治癌症的作用，特别是硫酸多糖具有多种生理活性‘。氨基酸和蛋白质在植物体内可以以游离形式存在，更多的是以与多糖、酚类化合物等结合的形式存在，均具有抗氧化活性，单宁．蛋白质复合物也可清除自由基。不饱和脂肪酸、维生素、矿物质等也均为有效的抗氧化成分。

1．4天然抗氧化剂的细胞抗氧化作用的研究进展。

1．4．1细胞抗氧化原理利用荧光探针DCFH—DA检测细胞内活性氧的变化。用抗氧化剂混合物以及无荧光的DCFH．DA处理肝癌细胞，二者进入细胞后，在细胞酯酶的作用下，DCFH—DA被分解成还原型二氯荧光素( DCFH) 。DCFH不能透过细胞膜到达细胞外。ABAP处理细胞，ABAP进入细胞后自发降解为过氧化自由基形成过氧化自由基，从而诱发细胞产生活性氧。细胞内的DCFH极易被活性氧氧化成荧光物氧化型二氯荧光素( DCH) ，荧光物DCH可通过分光光度法测定。抗氧化剂能够结第1章文献综述合细胞中的活性氧，从而阻断有绿色荧光的DCF的生成。细胞荧光物质的减少量就能反映该化合物的抗氧化能力。荧光值越小，抗氧化剂的抗氧化能力越高。

1．4．2天然抗氧化剂的细胞抗氧化能力研究细胞抗氧化测定方法往往通过抗细胞增殖能力来反映其体内抗氧化效果，主要用于食物如果蔬、谷物、豆类和纯植物化学物质等的抗氧化活性的评价。果蔬组织内的抗氧化活性成分是当前科学研究的热点，国外研究者相继从多种果蔬中提取并鉴定出抗氧化成分，并测定其抗氧化能力。Eberhardt等[ 68-69] 对苹果抑制Caco一2和HepG一2细胞增殖的能力进行了研究，结果表明，带皮和去皮的苹果沸水浸出物质量浓度各为50mg／mL时，对Caco一2的抑制率分别为( 43士1y％和(29士4．1)％，对HepG．2的抑制率分别为(57士0．21)％和(40士0．64)％，说明带皮苹果的提取物较去皮苹果的提取物抑制癌细胞增殖的能力强。常见水果中，蔓越橘、柠檬、苹果、草莓、葡萄、香蕉、桃子对HepG．2细胞增殖抑制的EC50值依次增加，即抑制细胞增殖的能力依次减弱；常见蔬菜中，菠菜、大白菜、红辣椒、洋葱、花椰菜、土豆和甜菜的EC50值依次增加，即抑制HepG一2细胞增殖的能力依次减弱。大量实验证实，被测物的提取浓度与抑制细胞增殖的能力是存在剂量一效应关系的，提取物浓度越大，抗增殖能力越强。Wol fe等测定了几十种常见水果蔬菜提取物的抗氧化活性，发现两种不同处理方法( 不用PBS和用PBS) 钡4得苹果的CAA值分别为( 21．9士4．0) “ molQE／1009和(17．2士2．0)p．mol QE／1009，野生蓝莓的CAA值分别为( 292士11) I．tmol QE／1009和(74．1士12．5)umol QE／1009。浆果类一般具有较高的CAA值，如野生蓝莓、草莓、黑莓、树莓等，而瓜果类的CAA值较低，如哈密瓜等。蔬菜中则是甜菜、花椰菜和红辣椒的CAA值较高。CAA值高低与总酚含量是密切相关的。谷物中也含有酚酸类、黄酮类、单宁等酚类化合物，含量和种类与果蔬中的相当，与果蔬不同的是谷物中的酚大多是结合酚，很多实验都证明谷物如有色稻米等具有抗氧化活性。研究发现，米糠提取物对细胞HL一60和MOL．4的IC50值分别为2．3mg／kg和2．8mg／kg。Hu Chun等【73J 用RAW264．7细胞系证明了深蓝色粒小麦的麦麸能使H：02自由基氧化产生的荧光迅速减少，且存在剂量．效应关系。采用CAA方法用于评价纯植物化学物质的抗氧化活性时发现：具有3’ ，4’ 一O一二羟基、2，3双键结合。酮基、3．羟基结构的类黄酮具有较高的CAA值；不同纯植物化学物质中，槲皮素的CAA值最高，山奈酚、表没食子儿茶素没食予酸酯(EGCG)、杨梅酮、木犀草素次之。以wbl fe等的CAA方法以及Honzel 掣7的基于人体血红细胞的CAP—e方法( cel l ．based anti ．oxi dantprotecti on as—say uti l i si ngerythrocytes) 为基础，Bl asa等，建立了CAA—RBC方法( cel l ul aranti oxi dantacti vi ty9 西南大学硕士学位论文uti l i si ngredbl oodcel l s) ，用该方法对各种提纯的黄酮类物质进行分析，发现异鼠李素、杨梅酮、山奈酚表现出较高细胞抗氧化活性，而木犀草素、EGCG、白藜芦醇、芹菜素和儿茶素表现出较低活性，与上述CAA方法分析得到的结果有一定差异。此外，CAA方法在豆类、咖啡、茶叶( 茶多酚) 等提取物的细胞抗氧化活性研究中也有应用。

2．1研究目的与意义桑叶是一种药食两用的天然植物资源，近年来，桑叶中的营养及功能成分成为国内外研究的热点，大量研究表明，桑叶中的生物活性物质如多酚类物质、黄酮甙，桑多糖、生物碱等，在降血糖、降血压、抗衰老、抗氧化，调节。肾上腺素、降低胆固醇、预防血栓，改善肠道健康，抗癌、抗过敏、防止动脉硬化、利尿等方面具有显著的功效。我国桑树资源丰富，而传统的栽桑养蚕模式单一，桑叶消耗量少，每年有大量的桑叶得不到有效的利用，考虑桑叶具有的功能成分特点，以及我国传统医学对桑叶的利用，以及茶饮在我国民间的普及，探索开发桑叶的新用途，将桑叶按照茶叶加工工艺制备加工桑茶，对桑叶利用具有十分重要的意义。中国是人类种茶、制茶、饮茶的发源地，茶文化源远流长。茶叶作为世界三大饮料之一，广受全球消费者欢迎，市场对其数量、质量的需求正在逐渐增加与提高，经济价值巨大。以桑作茶在我国已有一千多年历史，但我国直到1992年才开始发展桑叶茶，目前国内尚处于技术研究市场开发启动阶段，没有批量商品上市。随着人们消费观念和健康理念的转变，桑叶茶作为药食两用的健康食品，必将越来越被人们所青睐，具有广阔的市场前景。本研究拟采用药食两用资源桑鲜叶为原料，采用茶叶中绿茶加工工艺制备桑茶，特别考虑采用影响绿茶品质的关键工艺——杀青，并进行优化处理，来制备目标功能成分含量高及滋味品质好的桑茶，同时针对桑叶富含抗氧化的酚类物质等特点，对制备桑茶抗氧化功能作用进行深入研究，包括体外抗氧化活性和细胞内抗氧化活性，可为研究桑叶茶工艺特点、生物活性成分与其抗氧化活性之问的相关性提供了实验依据，为桑鲜叶资源的开发利用提供新的思路。考虑桑茶含有的抗氧化成分差异，为此，本实验在抗氧化活性研究中，考虑了不同溶剂提取对桑叶茶的抗氧化活性的影响，并分别采用了体外抗氧化方法和细胞内抗氧化方法对桑叶茶不同溶剂浸出物的抗氧化能力进行了研究，并对两种方法的测定结果做了相关性分析，为桑叶茶功能化开发和应用提供有关抗氧化方面的基础研究数据，有一定的意义。